Cistiti e vaginiti recidivanti:ruolo dei biofilm e delle persister cells.

Dalla fisiopatologia a nuove strategie terapeutiche

A. GRAZIOTTIN 1, P. P. ZANELLO 2, G. D’ERRICO 3

1Centro di Ginecologia e Sessuologia Medica

Ospedale San Raffaele Resnati, Milano, Italia

2Dipartimento di Scienze Biomediche,

Biotecnologiche e Traslazionali,

Unità di Microbiologia e Virologia

Università degli Studi di Parma, Parma, Italia

3Divisione di Ostetricia e Ginecologia

Ospedale Civile Di Vigevano, Pavia, Italia

RECURRENT CYSTITIS AND VAGINITIS: ROLE OF

BIOFILMS AND PERSISTER CELLS. FROM PATHOPHYSIOLOGY

TO NEW THERAPEUTIC STRATEGIES

Recurrent vaginitis and cystitis are a daily

challenge for the woman and the physician.

The recurrence worsens the symptoms’ severity,

increases comorbidities, both pelvic

(provoked vestibulodynia, bladder pain syndrome,

levator ani hyperactivity, introital

dyspareunia, obstructive constipation, chronic

pelvic pain) and cerebral (neuroinflammation

and depression), increases health costs,

worsens the quality of life. Antibiotics increase

the risk of bacterial resistences and

devastate the ecosystems: intestinal, vaginal

and mucocutaneous. Pathogenic biofilms are

the (still) neglected etiology of recurrences.

Biofilms are structured communities of bacteria

and yeasts, protected by a self-produced

polymeric matrix adherent to a living or inert

structures, such as medical devices. Biofims

can be intra or extracellular. Pathogens live

in a resting state in the deep biofilm layers as

“persister cells”, resistant to antibiotics and

host defences and ready to re-attack the host.

The paper updates the evidence on biofilms

and introduces new non-antibiotic strategies

of preventing and modulating recurrent

vaginitis and cystitis.

Key words: Cystitis - Vaginitis - Pelvis.

Vaginiti e cistiti recidivanti costituiscono

un problema di salute pesante per la

donna e la coppia. Costituiscono rispettiva

mente fino al 30% della richiesta di consultazione

ginecologica e di urologia femminile

1, 2. Sono fonte di grande frustrazione per

la donna che, non trovando risposte cliniche

efficaci, si orienta per l’autoterapia. Il

25% della spesa terapeutica in ginecologia

è investito in lavande vaginali e farmaci da

banco proprio per la cura dell’igiene intima

e delle vaginiti. La recidività causa frustrazione

anche per il medico, la cui competenza

terapeutica sembra essere tenuta in

scacco da patologie a torto considerate banali.

La recidività di vaginiti e cistiti è, invece,

causa non solo di esacerbazione dei

sintomi specifici, ma anche di crescenti e

costose comorbilità 3-5 (Tabella I), costose in

modo quantizzabile per la donna e la sanità

pubblica, in termini di spese sanitarie, consulenze

mediche, esami e farmaci. Costose

su dimensioni meno traducibili in denaro,

ma non per questo meno pesanti e significative,

in termine di danno alla salute e

alla vita personale e di coppia. L’escalation

di aggressività sul fronte degli antibiotici è

fallimentare, con dati inquietanti sul vertiginoso

crescere delle resistenze batteriche in

urologia 6 e ginecologia 7. È quindi necessario

un approccio innovativo, e tra le opzioni

perseguibili, una delle più promettenti

riguarda lo studio dei biofilm in ginecologia

e urologia.

Obiettivi del lavoro sono: 1) approfondire

questo nuovo scenario fisiopatologico con

una prospettiva clinica; 2) proporre un’alternativa

terapeutica alla terapia antibiotica

e alla antibiotico-profilassi nelle infezioni

uro-ginecologiche ricorrenti 8.

Studi preliminari suggeriscono, infatti,

che conoscenza e intervento sui biofilm

possano essere una via più valida ed efficace,

rispetto all’antibiotico-terapia, dimostratasi

perdente nel lungo termine 6.

Tabella I. — Cistiti ricorrenti, vestibulodinia provocata, dispareunia: l’evidenza sul peso delle comorbilità

–– La vestibulodinia provocata (VP) acquisita, associata a dispareunia introitale, è presente nel 60% delle donne con

cistiti ricorrenti/UTIs

–– Le donne con VP/dispareunia hanno:

–– una più alta prevalenza di cistiti/ UTIs (OR 4,54; P=0,03)

–– cistiti/UTIs più frequentemente causate da Escherichia coli UPEC, rispetto a quelle senza VP/dispareunia

–– sei o più episodi di cistiti/UTIs nei precedent 12 mesi (OR: 2,8; P=0,01)

–– tre o più cicli di antibiotici nello stesso periodo di osservazione (OR: 2,1; P=0,04)

–– le terapie antibiotiche per UTIs sono emerse come fattore predittivo indipendente di VP/dispareunia (perché

selezionano Candide molto aggressive e iper-risposte immunoallergiche agli antigeni della Candida)

–– punteggi più bassi nel Female Sexual Function Index (OR 3,1, con P≤0,01 in tutti i domini), e quindi una peggiore

funzione sessuale rispetto alle donne che non hanno VP/dispareunia

Vaginiti, cistiti e comorbilità

Perché è importante prevenire la recidività?

Sostanzialmente perché è molto impegnativa

e costosa dal punto di vista non

solo economico ma soprattutto della salute.

Le comorbilità attivate dalla recidività sono

gravi, complesse e richiedono un attento

sguardo clinico, specie da parte del ginecologo

che ha gli strumenti fisiopatologici e le

conoscenze terapeutiche per affrontarle in

modo efficace. Esse coinvolgono:

1. la vescica, contribuendo alla sindrome

della vescica dolorosa (Bladder Pain Syndrome,

BPS) che, negletta, può evolvere

fino alla temibile cistite interstiziale 9-11;

2. la vagina, con progressiva devastazione

degli ecosistemi anche per l’esito iatro-

geno di interventi farmacologici crescentemente

aggressivi che selezionano resistenze

batteriche e fungine sempre più agguerrite;

3. il vestibolo vaginale, con un quadro

flogistico che evolve verso il dolore cronico

e neuropatico, contribuendo alla vestibulodinìa

provocata, prima descritta come “sindrome

della vestibolite vulvare” (VVS) 4, 12-14;

4. il muscolo elevatore dell’ano, progressivamente

“iperattivo”, contratto, fino a diventare

dolente “mialgico” e molto dolente

15-17;

5. la funzione sessuale: la contrazione del

muscolo elevatore, che può essere primaria

o secondaria al dolore vestibolare e/o vescicale,

restringe l’entrata vaginale e contribuisce

ad un sintomo sessuale principe in

questo scenario, ossia il dolore ai rapporti

“dispareunia introitale” 18, 19;

6. la funzione evacuativa: la contrazione

difensiva del muscolo elevatore contribuisce

in modo determinante alla stipsi ostruttiva

20, 21. Essa causa a sua volta infiammazione

della parete rettale, perdita della

funzione di barriera e Leaky Gut Syndrome,

sindrome dell’intestino che perde con passaggio

di germi dal retto al sangue e ai vasi

linfatici e di qui a vagina e vescica 22, 23;

7. la depressione: flogosi vaginali e vescicali

recidivanti aumentano la produzione

di citochine infiammatorie che non solo

concorrono al dolore locale ma arrivano al

cervello, causando neuro infiammazione 5.

È questa la base biologica della depressione

spesso associata alla recidività, accanto alle

altre cause di ordine psichico e relazionale.

Il carico biologico ed emotivo della recidività,

in termini di salute fisica, psicosessuale e

relazionale, giustifica quindi una rinnovata

attenzione a queste patologie, focalizzata

allo studio del terreno biologico in cui si

sviluppano le flogosi e che contiene le chiavi

fisiopatologiche della recidività.

Figura 1. — Immagine al microscopio a scansione di biofilm extracellulare polimicrobico su supporto siliconico.

Esempio di biofilm costituito da comunità strutturate di cellule batteriche e fungine di specie diverse adese ad una

superficie inerte 29. (da Leonhard M. et al., 2013 con autorizzazione).

Biofilm

I biofilm rappresentano comunità strutturate

di cellule batteriche spesso di specie

diverse 24-26, anche di natura fungina 27, 28,

racchiuse in una matrice polimerica autoprodotta

ed adesa ad una superficie inerte

o vivente (Figura 1) 29.

Nell’ambiente vaginale, in condizioni fisiologiche

e in età fertile, il 90% della flora

microbica abitualmente presente in simbiosi

mutualistica con l’ospite è rappresentato

da lattobacilli che possono organizzarsi in

biofilm fisiologici e rappresentare l’aspetto

caratterizzante sano dell’ecosistema vaginale,

mentre il restante 10% è costituito da

batteri saprofiti 30-32. Nello squilibrio di questa

flora microbica residente si collocano le

infezioni ricorrenti uro-ginecologiche che

costituiscono un serio problema medico, in

quanto, attualmente, non esistono terapie

efficaci 33.

La dimostrazione che tutte le infezioni

uro-ginecologiche sono sostenute da biofilm

patogeni (Tabella II) 24, 32, 34-36 spiegherebbe

l’assente o incompleta risposta ai

farmaci e l’alta presenza di forme morbose

recidivanti uro-ginecologiche antibiotico resistenti,

insensibili agli effettori della risposta immune 37

e tendenti alla cronicizzazione 28, 38-42.

I biofilm patogeni presentano due localizzazioni

principali: extra- e intracellulari.

Localizzazioni extracellulari

I biofilm in vagina sono soprattutto extracellulari,

cioè posti alla superficie delle cellule

che rivestono la parete della vagina e

aggettano quindi verso la cavità, così come

i biofilm che rivestono la cute vulvare, che

aderiscono da un lato ai cheratinociti cutanei,

e si sviluppano poi verso l’esterno. La

struttura dei biofilm extracellulari è costituita

da una matrice esopolisaccaridica nella

quale sono scavati minuscoli canali d’acqua

che si anastomizzano fra loro, formando

una sorta di sistema circolatorio primitivo.

Essi possono organizzarsi sulla superficie di

differenti mucose o di supporti inerti, quali

i dispositivi medici 26. In ginecologia, sono

di particolare interesse i biofilm che compaiono

sulla superficie di dispositivi medici,

quali anello contraccettivo vaginale, pessari,

dispositivi intrauterini, impianti sottocutanei,

cateteri. I biofilm, sia a sviluppo sopramucoso,

sia su supporto inerte, stanno

assumendo un’importanza rilevante in molte

infezioni croniche e da impianti biomedici,

a carattere recidivante. Infatti, l’involucro

polisaccaridico, secreto dai microrganismi

patogeni, agisce come un sistema di protezione

(simile ai reticolati per le trincee di

guerra) che si oppone alla penetrazione dei

farmaci e agli effettori della risposta immunitaria.

Grazie a questa protezione, i microrganismi

presenti nel biofilm assumono uno

stato di bassa attività metabolica, mostrano

un’aumentata resistenza alle difese immunitarie

dell’ospite e alla terapia antibiotica,

sia perché meccanicamente più protetti e

quindi meno raggiungibili dagli stessi, sia

perché la limitatissima attività metabolica,

simile ad una sorta di quiescenza, relativa e

reversibile, li rende meno vulnerabili anche

ai princìpi attivi che li riuscissero a raggiungere28.

Nella parte più profonda del biofilm

è presente una sottopopolazione di cellule

batteriche quiescenti (0,1-1%) denominate

persister cells, completamente resistenti agli

antibiotici e alle difese immunitarie, pronte

a ripristinare la carica batterica preesistente

una volta completata la terapia antibiotica. A

differenza delle cellule batteriche resistenti

che crescono e si moltiplicano in presenza

di antibiotici, le persisters non crescono

in presenza di antibiotici. In questo caso la

resistenza agli antibiotici non è genotipica

cioè portata da plasmidi, troposomi o legata

ad eventi mutazionali, ma dovuta alla strategia

di queste cellule dormienti differenziatesi

in uno stato fenotipico protetto. La presenza

di persister cells nei biofilm batterici e

fungini ci spiega la difficoltà nel trattamento

delle infezioni biofilm correlate 43.

Negli strati profondi dei biofilm extracellulari,

verso quindi la mucosa o la superficie

inerte, si verifica un altro fenomeno di

grande importanza: un’elevata frequenza di

coniugazione tra i batteri che promuove lo

scambio di plasmidi, ossia di codice genetico

a DNA (Appendice 1). Alcuni plasmidi,

infatti, possono contenere geni che inducono

fenotipi batterici con resistenza multipla

agli antibiotici, o codificare per proteine che

interagendo con le molecole antibiotiche

ne neutralizzano l’attività 37, 44-47. I plasmidi

costituiscono una riserva complessa e mobilissima,

estremamente dinamica, di strategie

di aggressione, virulenza e resistenza

di eccezionale duttilità. Il biofilm è un’entità

dinamica, con un gradiente di attività

progressivamente più vivace a partire dalla

superficie (che aggetta verso la cavità) fino

ad arrivare verso la base del biofilm (verso

la mucosa), a più bassa attività metabolica e

può essere presente in organi come la vagina,

il cavo orale o l’intestino 48. In questi distretti,

e in prossimità dei biofilm, troviamo

cellule batteriche in moltiplicazione, pronte

al distacco e a colonizzare altri siti più distanti:

il cosiddetto “biofilm maturo”. In tal

caso, singoli batteri multiresistenti e aggregati

microbici che si distaccano in modo

continuo da un biofilm maturo, sia esso

monospecie, che multispecie, fungono da

inoculo persistente promuovendo nell’organismo

nuovi siti di colonizzazione e dando

luogo alle cosiddette infezioni polimicrobiche,

antibiotico-resistenti a crescita sessile,

tendenti alla cronicizzazione, che spiegano

poi recidività e comorbilità, per esempio tra

cistiti recidivanti e vestibolite vulvare con

vestibulodinìa provocata 4.

Nonostante le difficoltà nell’eradicazione

di batteri patogeni persistenti a livello

dell’apparato uro-genitale, esiste ancora

una limitata consapevolezza a livello clinico

dell’importanza dei biofilm batterici e fungini

nei processi infettivi e della più elevata

farmaco-resistenza ad essi associata 42.

Localizzazioni intracellulari

I biofilm patogeni tipici della vescica sono

caratterizzati da un ceppo di Escherichia

coli uro patogeno (Uro Pathogenic Escherichia

coli, UPEC), responsabile del 75-85%

delle cistiti recidivanti e della formazione

del biofilm intracellulare. In particolare, i

ceppi di Escherichia coli che possiedono

l’antigene K si tolgono il capside, entrano

nelle cellule dell’urotelio dove formano le

cosiddette “comunità batteriche intracellulari”

49-53 (Intracellular Bacterial Communities,

IBCs, Figura 2) 54. I batteri intracellulari

si organizzano in biofilm racchiusi in

una ricca matrice polisaccaridica, circondata

da un guscio protettivo di uroplachina

in prossimità della superficie, dove creano

rigonfiamenti simili a baccelli 38. I biofilm

intracellulari costituiscono ancora una volta

una riserva di germi poco attaccabile dagli

antibiotici e dalle difese immunitarie. Essi

causano infiammazione cronica della parete

vescicale fino a causare una “sindrome della

vescica dolorosa” che può evolvere fino alla

“cistite interstiziale” 55. Il periodo di tempo

che intercorre dalla colonizzazione da parte

di cellule batteriche di E. coli UPEC dell’urotelio

vescicale fino alla cistite interstiziale

conclamata può richiedere fino a 5-7 anni,

durante i quali si assiste ad una persistente

infiammazione negletta nelle sue caratteristiche

fisiopatologiche principali 56.

Figura 2. — Biofilm endogeni: le comunità batteriche intracellulari. Cellule batteriche di Escherichia coli uropatogeno,

principali responsabili del 75-85% delle cistiti recidivanti, possono formare biofilm intracellulari e costituire le “comunità

batteriche intracellulari” a localizzazione anatomica prevalentemente vescicale 54 (tratto da Rosen et al., 2007,

con autorizzazione).

Implicazioni cliniche

Secondo il Center for Disease Control

and Prevention (CDC) di Atlanta, GE, fino

all’80% delle infezioni batteriche che colpiscono

gli esseri umani nei paesi occidentali

è causato da biofilm polimicrobici. Pertanto,

le infezioni ricorrenti uro-ginecologiche

non devono più essere considerate come

infezioni sostenute da un singolo ceppo patogeno

ma come una sindrome polimicrobica

a crescita sessile caratterizzata da un

significativo aumento della carica batterica

aerobica, anaerobica e fungina con eventualmente

un ceppo patogeno dominante 57.

In particolare, Escherichia coli, frequentemente

presente nelle infezioni uro-ginecologiche,

forma un biofilm vescicale e vaginale

che può contenere batteri quiescenti

intracellulari di riserva: le persister cells.

Esse costituiscono circa l’1% degli elementi

batterici, sono completamente resistenti agli

antibiotici e al sistema immunitario, caratteristiche

cruciali responsabili del fallimento

delle terapie antibiotiche nelle infezioni recidivanti.

Completata la terapia antibiotica

o antifungina, infatti, le persister cells prontamente

si riattivano ripristinando la carica

batterica o fungina pre-esistente causando

una ricaduta dell’infezione 37. Il trattamento

antibiotico infatti, può essere risolutivo

sui batteri in fase planctonica, responsabili

delle riacutizzazioni infettive rilasciate dal

biofilm, ma non è in grado di eliminare la

comunità batterica sessile contenuta nello

stesso.

Inoltre, in entrambe le situazioni patologiche

della vescica e della vagina, gli antigeni

rilasciati dalle cellule sessili stimolano

la produzione di anticorpi che non riuscendo

nella corretta opsonizzazione immune

dei batteri all’interno del biofilm, determinano

un danno da immunocomplessi nel

tessuto circostante, contribuendo a cronicizzare

l’infiammazione tissutale e il dolore

che ne consegue anche in presenza di

un’eccellente risposta immunitaria cellulare

e umorale 55, 58, 59. Infine, anche la saltua

ria esfoliazione di batteri e cellule vescicali

dalla superficie del biofilm maturo contribuisce

a rendere tali infezioni croniche e

ricorrenti 37, 53.

Il biofilm è il laboratorio vivente nel quale

i plasmidi dei microrganismi patogeni

sperimentano la più ampia variabilità di

ricombinazioni fino all’emergere di “killer”

biologici antibiotico resistenti che si staccano

dal biofilm maturo per colonizzare altre

sedi locali fino all’invasione sistemica

(Appendice 1).

Fattori predisponenti, precipitanti e

di mantenimento della recidività

Fattori predisponenti

I fattori predisponenti includono:

—— copresenza di Escherichia coli uropatogeno

(UPEC) in vagina e vescica. Tutte

le donne affette da cistiti e vaginiti recidivanti

hanno una colonizzazione vaginale

da Escherichia coli UPE presente anche durante

periodi asintomatici. Lo studio della

composizione degli ecosistemi mostra un

rapporto invertito tra numero di coliformi e

di lattobacilli 67. Inoltre, la presenza di una

vaginite aerobica, o almeno la presenza di

un biofilm polimicrobico 68 vaginale comprendente

Escherichia coli, è stata sempre

rilevata nei giorni precedenti un episodio

di cistite. È stato dimostrato che nei 14 giorni

che precedono una Urinary Tract Infection

(UTI) la presenza di batteri periuretrali

aumenta dal 46% al 90%, la batteriuria dal

7% al 69%, l’esterasi leucocitaria dal 31% al

64%, la sintomatologia vaginale dal 3% al

43% 68. Come pure Escherichia coli UPEC

aumenta in modo significativo con l’aumento

della frequenza dei rapporti sessuali

(P=008) 69. Il biofilm da Escherichia coli,

presente contemporaneamente a livello vescicale

e vaginale, contiene persister cells,

completamente resistenti agli antibiotici e

al sistema immunitario, rendendo tali infezioni

croniche e ricorrenti. La progressione

verso la cronicizzazione è più rapida e gli

episodi di cistite più ravvicinati se il biofilm

vaginale non viene trattato;

—— fattori anatomici: brevità dell’uretra

femminile che facilita la risalita di germi;

—— ipoestrogenismo 1, 70, 71;

—— diabete e fattori dismetabolici associati

1, 72;

—— iperattività del muscolo elevatore

dell’ano 16;

—— fattori sessuali: scarso desiderio, inadeguata

lubrificazione con secchezza vaginale

facilitano le microabrasioni della mucosa

dell’introito vaginale contribuendo a

vaginiti, vestiboliti/vestibulodinia provocata,

dispareunia, ipertono difensivo del muscolo

elevatore, e cistiti postcoitali 1, 14;

—— sindrome del colon irritabile e infiammazione

della parete intestinale (“leaky gut

syndrome”) e stipsi ostruttiva 1, 20, 21.

Fattori precipitanti

Il rapporto sessuale, specie se in presenza

di pregresse vaginiti e cistiti, nonché di

ipertono del muscolo elevatore e di vestibulodinìa

provocata 4 rappresenta il fattore

precipitante più frequente. In effetti, il 60%

delle cistiti recidivanti è postcoitale. Compare

24-72 ore dopo un rapporto sessuale.

La causa è biomeccanica, dovuta al trauma

che la penetrazione determina sull’uretra

e sul trigono quando il muscolo contratto

spinge il membro maschile contro l’uretra

e contro l’osso pubico soprastante. L’uretra,

non più protetta dall’abituale manicotto

vascolare, decongesto a causa del dolore

che inibisce l’eccitazione e la protettiva

congestione vascolare periuretrale, viene

compressa ripetutamente contro l’osso. Il

trauma biomeccanico causa allora infiammazione

tessutale e attiva le IBCs di Eschericha

coli UPEC.

L’esposizione al freddo (cistite “a frigore”)

può scatenare la cistite attiva in presenza di

IBCs.

Fattori di mantenimento

I fattori di mantenimento sono molteplici.

Tra i principali vi sono:

1. l’inadeguata attenzione ai fattori predisponenti

e precipitanti;

2. la mancata/incompleta lettura fisiopatologia

delle cause della recidività e delle

comorbiltà associate;

3. il minimalismo terapeutico, che si limita

anche nelle linee guida internazionali

ad un’escalation di aggressività antibiotica,

sia per tipo di molecole che per durata dei

trattamenti 73;

4. la mancata compliance della donna

alla terapia.

Il razionale per un diverso intervento

preventivo e terapeutico

La progressione verso la cronicizzazione è

più rapida e gli episodi di cistite più ravvicinati

se il biofilm vescicale o vaginale non

viene trattato. Oggi è evidente che la migliore

terapia antibiotica a nostra disposizione

è solamente in grado di risolvere un episodio

acuto di cistite, mentre è completamente

inefficace nella prevenzione delle infezioni

uro-ginecologiche recidivanti. Per questi motivi

l’attenzione dei clinici e dei microbiologi

si è rivolta alla ricerca di alternative alla terapia

antibiotica, che spesso nelle cistiti e nelle

vaginiti recidivanti non solo risulta inefficace,

ma può stimolare la cosiddetta “SOS response”

e la formazione di persister cells, creando

ceppi batterici antibiotico-resistenti, nonché

elevata disbiosi intestinale e vaginale 74, 75. Le

strategie preventive e terapeutiche più attuali

sono riassunte in Tabella II 24, 32, 34-36.

In questo articolo ci limiteremo a discutere

i fattori che possono agire elettivamente

sui biofilm patogeni. Sfidare i biofilm è

(ancora) difficile. Ad oggi non sono ancora

disponibili sostanze antibiotiche o antifungine

in grado di evitare la formazione del

biofilm e neppure sono disponibili sostanze

che possano interferire sul “quorum sensing”,

segnale che dà il via alla formazione

del biofilm stesso, né di sostanze che possano

distruggere le persister cells o che possano

risvegliarle al fine di renderle sensibili

agli antibiotici (Tabella III).

Numerose evidenze in letteratura sottolineano

l’importanza e l’utilità di sostanze

alternative ai comuni antibiotici per la prevenzione

e il trattamento delle infezioni a

carico dell’apparato urogenitale, come ad

esempio: le sostanze antiadesive, i lattobacilli,

l’N-acetilcisteina, la lattoferrina, Morinda

citrifolia, mirtillo rosso o cranberry

(Tabella IV). Il razionale d’azione può includere

le seguenti sostanze.

Tabella III. — Strategie di prevenzione delle infezioni

recidivanti associate a biofilm.

–– Bloccare l’adesione delle cellule batteriche

–– Prevenire la crescita microbica

–– Interferire con i sistemi di comunicazione inter-cellulari

–– Disgregare le matrici polisaccaridiche già formate

–– Deprimere l’iperfunzione della pompa di efflusso del

biofilm

–– Distruggere o evitare la formazione di persister cells

–– Risvegliare le persisters per renderle sensibili ai farmaci

Tabella IV. — Prevenzione e modulazione dei biofilm

patogeni. I principi attivi non-antibiotico utili

includono:

–– D-mannosio

–– N-acetilcisteina (NAC)

–– Probiotici

–– Lattoferrina

–– Morinda citrifolia

–– Cranberry

Figura 3. — Schema d’azione del D-Mannosio nei confronti

di Escherichia Coli UPEC. Il D-Mannosio, zucchero

metabolicamente inerte estratto dalla betulla, si lega alla

punta delle fimbrie di E. coli impedendone l’aggancio

alle cellule dell’urotelio. Il D-Mannosio intercetta quindi

il germe impedendone meccanicamente l’azione lesiva.

(L’immagine è stata gentilmente fornita dal Dott. Giovanni

D’Errico).

Sostanze antiadesive: il D-mannosio

Il D-mannosio è un monosaccaride a

basso peso molecolare che si estrae dal legno

della betulla. Una volta assunto nell’organismo

umano non viene trasformato in

glicogeno, non viene metabolizzato, ma

viene eliminato immodificato attraverso

il rene, con le urine. Considerata l’elevata

affinità del D-mannosio per le lectine

di Escherichia coli e di molti altri batteri

flagellati, l’utilizzo del D-mannosio rappresenta

sempre di più una strategia vincente

sia in interventi di profilassi che di

cura delle infezioni delle vie urinarie (UTI),

impedendo l’impianto del microrganismo a

livello dell’epitelio vescicale e vaginale, o

facilitandone il distacco meccanico 76-78. Peraltro,

l’utilizzo delle sostanze antiadesive

rappresenta un’efficace strategia che permette

di interferire con il primo stadio del

processo infettivo determinato dal legame

del fattore di virulenza FimH, presente alla

sommità dei pili di tipo 1 di Escherichia

coli, con gli oligosaccaridi presenti sulla superficie

delle cellule dell’epitelio vescicale

e vaginale (Figura 3) 79-85. I pili di tipo 1

di E. coli sono espressi in più del 90% dei

ceppi e sono indispensabili per l’adesione

alle cellule vescicali e vaginali, per la formazione

di IBCs e per la differenziazione

in persister cells. Il D-mannosio agisce impedendo

l’impianto di E. coli sui recettori

delle cellule vescicali e dell’epitelio vaginale,

prima tappa rispettivamente di cistiti

interstiziali e di vaginiti aerobiche con formazione

di biofilm, facilitandone il distacco

e la conseguente eliminazione con il flusso

urinario. Il D-mannosio favorisce anche la

ristrutturazione delle mucose danneggiate,

specialmente di quella vaginale, garantendo

così una maggiore protezione da successivi

insulti batterici 86.

N-acetilcisteina

La comprovata efficacia del D-mannosio

nei confronti delle forme batteriche planctoniche

tuttavia, potrebbe contrapporsi

alla sua parziale inefficacia quando i batteri

si trovino strutturati in biofilm. Per tale

motivo l’utilizzo di N-acetilcisteina (NAC),

un derivato N-acetilato dell’aminoacido cisteina,

che da decenni viene utilizzato per

di notevole efficacia, in quanto ha dimostrato

un’elevata attività nell’inibire l’adesione

batterica e nel dissolvere la matrice

del biofilm maturo 87, 88. Recenti risultati

sperimentali hanno confermato oltre ad

un’attività antiossidante, l’efficacia del NAC

nella disgregazione e nella riduzione del

numero di forme vitali di batteri presenti

nei biofilm, rispettivamente di Staphylococcus

aureus ed Escherichia coli. In questi

studi è stata messa in evidenza l’efficacia

di fosfomicina e ibuprofene in sinergia con

NAC nelle infezioni causate da biofilm da

UPEC e nelle infezioni urinarie non complicate.

L’attività esplicata dal NAC anche

quando utilizzato in associazione sinergica

con i singoli antibiotici sta aprendo nuove

ed importanti prospettive terapeutiche

nelle patologie infettive croniche delle vie

respiratorie e delle vie urinarie determinate

da microrganismi formanti biofilm che è

quasi impossibile eradicare con le comuni

terapie antibiotiche 88, 89. L’elevata attività

antiossidante del NAC, la sua capacità di

inibire la formazione di biofilm, di disgregare

la membrana polimerica di biofilm

batterici e fungini maturi, rende i patogeni

sensibili ai farmaci e agli effettori della risposta

immune 90.

Probiotici

Evidenze sperimentali sempre più numerose

sostengono che l’approccio naturale

finalizzato alla profilassi e alla cura delle

patologie a carico dell’apparato urogenitale

debba comprendere anche l’utilizzo di

probiotici, microrganismi vivi che, se somministrati

in quantità adeguata, hanno un

effetto benefico per l’ospite 91. I probiotici,

specie se veicolati con una opportuna

tecnica tale da renderli compatibili con

l’ecosistema vaginale residente, e con le

caratteristiche chimico fisiche e microbiologiche

dell’ambiente vaginale, possono

determinare un potenziamento del sistema

immunitario localmente stimolando il reclutamento

di linfociti T helper e di monociti

92. Inoltre, i probiotici mettono in atto

una serie di meccanismi per svolgere un effetto

protettivo a difesa della mucosa vaginale

dall’aggressione di numerosi patogeni,

in particolare, mediante la produzione di

biosurfattanti che inibiscono l’adesione dei

patogeni alle cellule vaginali, e formando

un biofilm fisiologico che riveste la mucosa

vaginale e la protegge dall’aggressione

dei microrganismi potenzialmente patogeni

39, 93, 94. Recentemente, la produzione di

biosurfattanti da parte dei lattobacilli, e in

particolare della surlactina, è stata descritta

per Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus

fermentum. La surlactina dimostra un

effetto inibitorio sull’adesione di Enterococcus

faecalis, Escherichia coli, Candida

albicans e della maggior parte dei germi

responsabili delle infezioni urogenitali 95.

Inoltre, i lattobacilli naturalmente acido resistenti

producono acidi organici (specialmente

acido lattico) per mantenere il pH

vaginale vicino a 4, contrastando lo sviluppo

della maggior parte dei patogeni vaginali

che risultano spesso sensibili a bassi

valori di pH.

I lattobacilli producono anche sostanze

ad attività antibatterica quali bacteriocine

e perossido di idrogeno che inibiscono la

crescita dei patogeni, e l’enzima arginino

deaminasi che inibisce la crescita dei batteri

anaerobi patogeni associati alla vaginosi

batterica e del Trichomonas vaginalis 96. Infine,

la co-aggregazione dei lattobacilli con

i patogeni impedisce l’accesso di questi

ultimi ai recettori tissutali e la loro adesione

all’epitelio, determinando un’inibizione

della colonizzazione dei ceppi patogeni.

Il processo di coaggregazione è specifico

per certi ceppi ed è stato dimostrato, ad

esempio, che L. acidophilus, L. gasseri e L.

jensenii, isolati dall’ambiente vaginale, coaggregano

con C. albicans, E. coli e G. vaginalis,

impedendone così l’adesione sulla

superficie epiteliale, prima tappa nella formazione

del biofilm 97.

Ristabilire l’equilibrio microbico vaginale

mediante l’utilizzo di lattobacilli, rappresenta

pertanto un approccio fisiologicamente

orientato a lavorare sul “terreno” vaginale

per aumentare le sue naturali capacità di

difesa nei confronti dei microrganismi patogeni,

specialmente in episodi di vaginosi batterica,

in cui l’alterazione della flora batterica

residente è una delle cause patogenetiche

della malattia, oppure di cistiti recidivanti,

in cui E. coli UPEC è in testa alla

lista dei germi aggressori. Tuttavia, recenti

studi condotti in ginecologia ci suggeriscono

una generica efficacia dei probiotici nelle

suddette condizioni cliniche, ma non ci

forniscono ancora un’adeguata indicazione

specie-specifica basata sulla forza della evidenza

di un significativo effetto sul singolo

agente patologico 98.

Lattoferrina

Un’altra sostanza capace di interferire con

le capacità di aggregazione dei batteri e dei

virus con le membrane cellulari dell’ospite

è rappresentata dalla glicoproteina lattoferrina

che, in combinazione con lo ione ferrico,

possiede interessanti proprietà nel modulare

e nell’interferire con i meccanismi di

adesione batterici 99. La lattoferrina è una

glicoproteina multifunzionale che appartiene

alla famiglia delle transferrine, possiede

due siti di legame per lo ione ferrico

(Fe3+) il quale gioca un importante ruolo

di regolazione del sistema immunitario e

di difesa contro batteri, funghi, virus, compresi

Herpes virus e Papilloma virus che

usano l’eparan-solfato delle cellule superficiali

come recettore 100, 101. In particolare, è

stato dimostrato che la lattoferrina stimola

il sistema immunitario adattativo, possiede

attività batteriostatica, battericida, antivirale,

antifungina, anti-infiammatoria, inibisce

l’adesione e l’internalizzazione batterica e

la formazione di biofilm 102, 103.

L’attività batteriostatica sembrerebbe in

parte essere esplicata dal sequestro del ferro

impedendone così l’utilizzo da parte dei

batteri e inibendone la crescita. L’attività

battericida e la lisi della cellula batterica,

invece, sembrerebbe essere indotta dal legame

al lipopolisaccaride dei batteri Gram

negativi o all’acido lipoico dei batteri Gram

positivi tramite la lattoferricina. Inoltre,

l’inibizione dell’adesione e dell’internalizzazione

batterica sembra essere indotta da

legame competitivo ai recettori cellulari e

idrolisi delle strutture adesive batteriche. La

lattoferrina ha anche dimostrato interessanti

proprietà nell’inibire l’aggregazione batterica

e la formazione di biofilm di varie

specie batteriche, in particolare di E. coli e

P. aeruginosa 104.

L’azione antivirale della lattoferrina sembrerebbe

esplicarsi mediante un meccanismo

d’azione diretto, attraverso il legame a

specifiche proteine strutturali e non strutturali

virali e cellulari inibendo l’interazione

virus-cellula, legame necessario per

l’instaurarsi del processo infettivo; oppure

un meccanismo indiretto, inibendo la morte

cellulare indotta dall’infezione da parte

di virus citopatici come è stato osservato

ad esempio per infezioni da Citomegalovirus

105.

Morinda citrifolia

La specie Morinda citrifolia è una pianta

che appartiene alla famiglia Rubiaceae. Il

genere Morinda comprende circa 80 specie

che crescono tutte esclusivamente in zone

temperate climatiche tropicali, e il nome latino

della specie, citrifolia, fa riferimento

alla somiglianza delle sue foglie con quelle

di alcune specie di agrumi (Citrus sp.).

Conosciuta anche come Gelso indiano,

Nonu, Nono, Lada Munja e Canary wood,

il nome comunemente più usato è Noni.

La Morinda citrifolia, originaria del sud-est

asiatico, tropicale e temperato caldo, è diffusa

dall’India fino a Taiwan e fino all’Australia

settentrionale. Per oltre 2000 anni i

polinesiani hanno utilizzato foglie, frutti e

radici della Morinda citrifolia per nutrirsi

e creare rimedi efficaci contro centinaia di

malattie contribuendo a conferirgli il titolo

di pianta sacra. Per secoli il suo frutto

è stato riconosciuto come un eccellente

fonte di alimentazione 106. Prevalentemente,

il frutto contiene acidi grassi, mentre le

radici e la corteccia contengono antrachinoni

107. Il numero elevato di applicazioni

e impieghi medici della Morinda citrifolia

sono una conseguenza della sua ricchezza

in vari componenti chimici: proxeronina,

scopoletina, acido octoanoico, potassio,

vitamina C, terpenoidi, alcaloidi, antrachinoni,

acido linoleico, alizarina, aminoacidi,

flavoni, glicosidi 106-109. In particolare, l’alcaloide

proxeronina a livello intestinale viene

metabolizzato e convertito dall’enzima

proxeronase in xeronina, caratterizzata da

un’ampia gamma di attività biologiche 111.

L’alcaloide XERONINA agisce come chaperon

molecolare garantendo l’acquisizione

della corretta struttura tridimensionale delle

proteine e stimolando la ghiandola pineale

responsabile della secrezione di due

dei principali ormoni del sistema nervoso:

serotonina e melatonina. L’alcaloide xeronina

è un metabolita con dimostrata attività

adiuvante in caso di pressione alta, crampi

mestruali, artrite, ulcere gastriche, distorsioni,

lesioni, depressione, senilità, cattiva

digestione, tossicodipendenza, e dolore 112.

Negli ultimi anni, il crescente interesse verso

i rimedi fitoterapici, in particolare nei

confronti del succo di Noni e dei composti

isolati dal frutto, ha permesso la pubblicazione

di numerosi lavori scientifici. Questi

studi sembrano confermare una vasta gamma

di effetti potenzialmente terapeutici: attività

antibatterica, antivirale, antitumorale,

analgesica, ipotensiva, anti-infiammatoria,

immunomodulatoria e antiossidante 113-124.

Mirtillo rosso (Cranberry)

Per decenni, si è creduto che l’effetto

benefico del cranberry sul tratto urinario

fosse dovuto all’acidità prodotta dalla trasformazione

dell’acido benzoico in acido

ippurico nelle urine. Questo abbassamento

del pH renderebbe le urine un terreno di

crescita non favorevole per i batteri patogeni

125. Attualmente si è compreso però, che

il bisogno di combattere batteri acidofili

come Escherichia coli consiglierebbe invece

l’alcalinizzazione dell’ambiente, anziché

la sua acidificazione (tra gli effetti del cranberry).

Inoltre, in presenza di una vescica

infiammata, l’acidificazione causerebbe dolori

maggiori rispetto a un pH neutro o alcalino,

e si rischierebbe la cronicizzazione

del dolore o addirittura la creazione di un

dolore neurologico persistente.

Ultimamente viene ipotizzato un suo effetto

nel prevenire l’adesione dei patogeni

sull’epitelio vescicale, tuttavia, è importante

sottolineare come l’attuale utilizzo di tale

derivato vegetale in caso di infezioni urinarie

non sia stato ancora validato. Una recente

review pubblicata nel Cochrane Summaries

dell’aprile 2013 ha confrontato 24

studi indipendenti e ha concluso che non

ci sono differenze significative tra l’utilizzo

del mirtillo rosso e il placebo (controllo non

trattato), ma che è addirittura sconsigliato

il suo utilizzo per lunghi periodi. Inoltre,

la stessa ricerca ha evidenziato come per

la prevenzione delle UTI ricorrenti il Dmannosio

debba essere preferito rispetto ai

prodotti a base di succo di mirtillo 126.

L’intervento preventivo e di modulazione

dei biofilm va naturalmente inserito in una

visione terapeutica strategica attenta alla

correzione dei fattori predisponenti, precipitanti

e di mantenimento, oggetto di precedenti

pubblicazioni, cui si rimanda alla

Tabella V 1, 14.

Tabella V. — Le opzioni preventive e terapeutiche per il reservoir vescicale prevedono una strategia multisistemica

con riduzione dei fattori predisponenti, precipitanti e di mantenimento.

1. Normalizzazione degli estrogeni vaginali (se ipoestrogenismo) e del pH

2. Ottimizzazione del controllo metabolico glicemico

3. Stili di vita appropriati (riduzione di lieviti e zuccheri, abbigliamento che non causi irritazioni/abrasioni delle mucose

genitali)

4. Rilassamento dell’iperattività dell’elevatore dell’ano in caso di comorbilità tra cistiti recidivanti e dispareunia con

vestibulodinìa provocata (fisioterapia, biofeedback di rllassamento)

5. Miglioramento della stipsi ostruttiva e della IBS spesso associata (magrogol, consigli alimentari, gastroenterologo)

6. Riduzione della carica batterica del germe patogeno

7. Riduzione dell’aggressività di E. coli UPEC

8. Ripristino del biofilm vescicale di glusoaminoglicani (GAG)

9. Ostacolo alla formazione dei biofilms endocellulari patogeni

Tratto e modificato da Graziottin A 1

Conclusioni

La comorbilità tra cistiti e vaginiti recidivanti

è elevata e può superare il 60% dei

casi. Nelle forme di cistite recidivante si assiste

alla presenza o alla formazione di un

biofilm polimicrobico quasi sempre contenente

Escherichia coli e presente anche a

livello vaginale. I microrganismi patogeni

contenuti nel biofilm sono antibiotico-resistenti

e insensibili agli effettori della risposta

immunitaria innata e adattativa. La

saltuaria e imprevedibile riattivazione di

questa riserva di batteri, a localizzazione intra-

o extracellulare, giustifica la ricorrenza

e la cronicizzazione di queste infezioni e

impone quindi una nuova strategia terapeutica.

Prevenzione e trattamento delle infezioni

acute e croniche sostenute da biofilm,

devono mirare a bloccare l’adesione delle

cellule batteriche sulla superficie epiteliale,

prevenire la crescita microbica, inibire

l’espansione dei patogeni, e disgregare le

matrici polisaccaridiche formate.

L’utilizzo di principi attivi efficaci sui biofilm

patogeni vescicali e vaginali rappresenta

una frontiera preventiva e terapeutica più

efficace e fisiologicamente orientata rispetto

alle terapie antibiotiche, che devono essere

usate in modo molto più restrittivo e mirato.

In particolare, la sinergia tra D-mannosio,

lattoferrina, NAC e lattobacilli, potrebbe

permettere di beneficiare contemporaneamente

dell’attività antiadesiva, battericida,

antivirale, di inibizione dell’internalizzazione

di UPEC portatore dell’antigene K. Inoltre

potrebbe favorire il ripristino dell’ecosistema

vaginale e del corretto pH; ostacolare

la formazione del biofilm patologico, e soprattutto

disgregare la membrana polimerica

del biofilm maturo per rendere i batteri

finalmente sensibili all’azione dei farmaci e

alla risposta immunitaria. Una strategia che

merita di essere esplorata in studi clinici

controllati.

Riassunto

Vaginiti e cistiti recidivanti costituiscono una sfida

quotidiana per la donna e per il medico. La loro

recidività peggiora la gravità dei sintomi, comporta

crescenti comorbilità loco regionali (vestibulodinìa

provocata, sindrome della vescica dolorosa, iperattività

del muscolo elevatore dell’ano, dispareunia

introitale, stipsi ostruttiva, dolore pelvico cronico)

e a distanza (neuroinfiammazione e depressione),

aumenta i costi sanitari, peggiora la qualità di vita.

Gli antibiotici aumentano il rischio di resistenze

batteriche e devastano gli ecosistemi intestinali,

vaginali e mucocutanei. La causa finora negletta

della recidività sono i biofilm patogeni: comunità

strutturate di cellule batteriche e fungine racchiuse

in una matrice polimerica autoprodotta ed adesa

ad una superficie vivente o inerte, come i dispositivi

medici. I biofilm possono essere intra- o extracellulari.

I germi patogeni restano protetti negli

strati profondi in forma di “persister cells”, poco

aggredibili da antibiotici e difese immunitarie e

pronti a riaggredire l’ospite. L’articolo discute le

nuove conoscenze sui biofilm e presenta modalità

alternative di prevenzione e terapia delle vaginiti e

cistiti recidivanti.

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Parte dell’articolo è stato oggetto della Lettura “Vaginiti

e cistiti recidivanti: il binomio diabolico” presentato dalla

Prof.ssa Graziottin al Congresso Nazionale della Società Italiana

di Ginecologia e Ostetricia (SIGO), tenutosi a Napoli,

dal 6 al 9 ottobre 2013.

Conflicts of interest.—Graziottin A is in the speaker’s bureau

of Deakos, Epitech, Menarini, Sanofi, Lo.Li.Pharma, and in the

advisory board of Bayer, Menarini, Pfizer. She is also a consultant

for Bayer, Deakos, Epitech, Menarini, Jansseng-Cilag, Palatin.

Zanello PP and D’Errico G are consultants for Deakos.

Received on August 8, 2014.

Accepted for publication on August 10, 2014.

Appendice 1

Plasmidi batterici e fungini

I plasmidi sono molecole di DNA di dimensioni

ridotte, capaci di esistere come elementi genetici

autonomi all’interno delle cellule. Sono molto diffusi

fra i microrganismi, trovandosi in gran parte dei

batteri (Procarioti), e in alcuni lieviti (Eucarioti unicellulari)

60-62. Plasmidi lineari sono stati scoperti in

batteri del genere Streptomyces e Borrelia, ma il loro

DNA è generalmente a doppia elica circolare. I plasmidi

sono circa 20 volte più piccoli dei cromosomi,

con grande diversità nelle loro dimensioni: da un

migliaio a circa un milione di coppie di nucleotidi.

Inoltre, esistono migliaia di plasmidi diversi: basti

pensare che nel solo enterobatterio Escherichia coli

ne sono stati scoperti diverse centinaia 63. I plasmidi

sono capaci di replicarsi all’interno della cellula

microbica in maniera indipendente rispetto al

processo di replicazione del cromosoma, tuttavia,

il numero di copie di ogni plasmide all’interno di

una cellula è costante grazie a molecole regolatrici

che impediscono sia l’eccessiva frequenza di replicazione,

che porterebbe a un aumento del numero

di copie, sia una più bassa velocità di replicazione

che porterebbe ad una eccessiva riduzione del numero

di copie fino alla loro scomparsa 64. Tutti i

plasmidi contengono i geni necessari per la loro

replicazione, per il controllo del numero di copie

e per l’incompatibilità con plasmidi appartenenti

allo stesso gruppo 62. Essi rappresentano un tesoro

di informazioni estremamente mobili, che usano il

codice del DNA, ma sono staccate dai cromosomi

e possono essere trasferite rapidamente da un batterio

all’altro insieme alle informazioni critiche che

veicolano 62, 65, 66. L’emergere di plasmidi “ibridi” che

veicolano contemporaneamente fattori di virulenza

e di resistenza agli antibiotici, ben documentati per

esempio nei biofilm contenenti Escherichia coli,

stanno emergendo come elemento di ulteriore preoccupazione

a livello scientifico e clinico 64.