Cistiti e vaginiti recidivanti:ruolo dei biofilm e delle persister cells.

Dalla fisiopatologia a nuove strategie terapeutiche

A. GRAZIOTTIN 1, P. P. ZANELLO 2, G. D’ERRICO 3

1Centro di Ginecologia e Sessuologia Medica

Ospedale San Raffaele Resnati, Milano, Italia

2Dipartimento di Scienze Biomediche,

Biotecnologiche e Traslazionali,

Unità di Microbiologia e Virologia

Università degli Studi di Parma, Parma, Italia

3Divisione di Ostetricia e Ginecologia

Ospedale Civile Di Vigevano, Pavia, Italia

RECURRENT CYSTITIS AND VAGINITIS: ROLE OF

BIOFILMS AND PERSISTER CELLS. FROM PATHOPHYSIOLOGY

TO NEW THERAPEUTIC STRATEGIES

Recurrent vaginitis and cystitis are a daily

challenge for the woman and the physician.

The recurrence worsens the symptoms’ severity,

increases comorbidities, both pelvic

(provoked vestibulodynia, bladder pain syndrome,

levator ani hyperactivity, introital

dyspareunia, obstructive constipation, chronic

pelvic pain) and cerebral (neuroinflammation

and depression), increases health costs,

worsens the quality of life. Antibiotics increase

the risk of bacterial resistences and

devastate the ecosystems: intestinal, vaginal

and mucocutaneous. Pathogenic biofilms are

the (still) neglected etiology of recurrences.

Biofilms are structured communities of bacteria

and yeasts, protected by a self-produced

polymeric matrix adherent to a living or inert

structures, such as medical devices. Biofims

can be intra or extracellular. Pathogens live

in a resting state in the deep biofilm layers as

“persister cells”, resistant to antibiotics and

host defences and ready to re-attack the host.

The paper updates the evidence on biofilms

and introduces new non-antibiotic strategies

of preventing and modulating recurrent

vaginitis and cystitis.

Key words: Cystitis - Vaginitis - Pelvis.

Vaginiti e cistiti recidivanti costituiscono

un problema di salute pesante per la

donna e la coppia. Costituiscono rispettiva

mente fino al 30% della richiesta di consultazione

ginecologica e di urologia femminile

1, 2. Sono fonte di grande frustrazione per

la donna che, non trovando risposte cliniche

efficaci, si orienta per l’autoterapia. Il

25% della spesa terapeutica in ginecologia

è investito in lavande vaginali e farmaci da

banco proprio per la cura dell’igiene intima

e delle vaginiti. La recidività causa frustrazione

anche per il medico, la cui competenza

terapeutica sembra essere tenuta in

scacco da patologie a torto considerate banali.

La recidività di vaginiti e cistiti è, invece,

causa non solo di esacerbazione dei

sintomi specifici, ma anche di crescenti e

costose comorbilità 3-5 (Tabella I), costose in

modo quantizzabile per la donna e la sanità

pubblica, in termini di spese sanitarie, consulenze

mediche, esami e farmaci. Costose

su dimensioni meno traducibili in denaro,

ma non per questo meno pesanti e significative,

in termine di danno alla salute e

alla vita personale e di coppia. L’escalation

di aggressività sul fronte degli antibiotici è

fallimentare, con dati inquietanti sul vertiginoso

crescere delle resistenze batteriche in

urologia 6 e ginecologia 7. È quindi necessario

un approccio innovativo, e tra le opzioni

perseguibili, una delle più promettenti

riguarda lo studio dei biofilm in ginecologia

e urologia.

Obiettivi del lavoro sono: 1) approfondire

questo nuovo scenario fisiopatologico con

una prospettiva clinica; 2) proporre un’alternativa

terapeutica alla terapia antibiotica

e alla antibiotico-profilassi nelle infezioni

uro-ginecologiche ricorrenti 8.

Studi preliminari suggeriscono, infatti,

che conoscenza e intervento sui biofilm

possano essere una via più valida ed efficace,

rispetto all’antibiotico-terapia, dimostratasi

perdente nel lungo termine 6.

Tabella I. — Cistiti ricorrenti, vestibulodinia provocata, dispareunia: l’evidenza sul peso delle comorbilità

–– La vestibulodinia provocata (VP) acquisita, associata a dispareunia introitale, è presente nel 60% delle donne con

cistiti ricorrenti/UTIs

–– Le donne con VP/dispareunia hanno:

–– una più alta prevalenza di cistiti/ UTIs (OR 4,54; P=0,03)

–– cistiti/UTIs più frequentemente causate da Escherichia coli UPEC, rispetto a quelle senza VP/dispareunia

–– sei o più episodi di cistiti/UTIs nei precedent 12 mesi (OR: 2,8; P=0,01)

–– tre o più cicli di antibiotici nello stesso periodo di osservazione (OR: 2,1; P=0,04)

–– le terapie antibiotiche per UTIs sono emerse come fattore predittivo indipendente di VP/dispareunia (perché

selezionano Candide molto aggressive e iper-risposte immunoallergiche agli antigeni della Candida)

–– punteggi più bassi nel Female Sexual Function Index (OR 3,1, con P≤0,01 in tutti i domini), e quindi una peggiore

funzione sessuale rispetto alle donne che non hanno VP/dispareunia

Vaginiti, cistiti e comorbilità

Perché è importante prevenire la recidività?

Sostanzialmente perché è molto impegnativa

e costosa dal punto di vista non

solo economico ma soprattutto della salute.

Le comorbilità attivate dalla recidività sono

gravi, complesse e richiedono un attento

sguardo clinico, specie da parte del ginecologo

che ha gli strumenti fisiopatologici e le

conoscenze terapeutiche per affrontarle in

modo efficace. Esse coinvolgono:

1. la vescica, contribuendo alla sindrome

della vescica dolorosa (Bladder Pain Syndrome,

BPS) che, negletta, può evolvere

fino alla temibile cistite interstiziale 9-11;

2. la vagina, con progressiva devastazione

degli ecosistemi anche per l’esito iatro-

geno di interventi farmacologici crescentemente

aggressivi che selezionano resistenze

batteriche e fungine sempre più agguerrite;

3. il vestibolo vaginale, con un quadro

flogistico che evolve verso il dolore cronico

e neuropatico, contribuendo alla vestibulodinìa

provocata, prima descritta come “sindrome

della vestibolite vulvare” (VVS) 4, 12-14;

4. il muscolo elevatore dell’ano, progressivamente

“iperattivo”, contratto, fino a diventare

dolente “mialgico” e molto dolente

15-17;

5. la funzione sessuale: la contrazione del

muscolo elevatore, che può essere primaria

o secondaria al dolore vestibolare e/o vescicale,

restringe l’entrata vaginale e contribuisce

ad un sintomo sessuale principe in

questo scenario, ossia il dolore ai rapporti

“dispareunia introitale” 18, 19;

6. la funzione evacuativa: la contrazione

difensiva del muscolo elevatore contribuisce

in modo determinante alla stipsi ostruttiva

20, 21. Essa causa a sua volta infiammazione

della parete rettale, perdita della

funzione di barriera e Leaky Gut Syndrome,

sindrome dell’intestino che perde con passaggio

di germi dal retto al sangue e ai vasi

linfatici e di qui a vagina e vescica 22, 23;

7. la depressione: flogosi vaginali e vescicali

recidivanti aumentano la produzione

di citochine infiammatorie che non solo

concorrono al dolore locale ma arrivano al

cervello, causando neuro infiammazione 5.

È questa la base biologica della depressione

spesso associata alla recidività, accanto alle

altre cause di ordine psichico e relazionale.

Il carico biologico ed emotivo della recidività,

in termini di salute fisica, psicosessuale e

relazionale, giustifica quindi una rinnovata

attenzione a queste patologie, focalizzata

allo studio del terreno biologico in cui si

sviluppano le flogosi e che contiene le chiavi

fisiopatologiche della recidività.

Figura 1. — Immagine al microscopio a scansione di biofilm extracellulare polimicrobico su supporto siliconico.

Esempio di biofilm costituito da comunità strutturate di cellule batteriche e fungine di specie diverse adese ad una

superficie inerte 29. (da Leonhard M. et al., 2013 con autorizzazione).

Biofilm

I biofilm rappresentano comunità strutturate

di cellule batteriche spesso di specie

diverse 24-26, anche di natura fungina 27, 28,

racchiuse in una matrice polimerica autoprodotta

ed adesa ad una superficie inerte

o vivente (Figura 1) 29.

Nell’ambiente vaginale, in condizioni fisiologiche

e in età fertile, il 90% della flora

microbica abitualmente presente in simbiosi

mutualistica con l’ospite è rappresentato

da lattobacilli che possono organizzarsi in

biofilm fisiologici e rappresentare l’aspetto

caratterizzante sano dell’ecosistema vaginale,

mentre il restante 10% è costituito da

batteri saprofiti 30-32. Nello squilibrio di questa

flora microbica residente si collocano le

infezioni ricorrenti uro-ginecologiche che

costituiscono un serio problema medico, in

quanto, attualmente, non esistono terapie

efficaci 33.

La dimostrazione che tutte le infezioni

uro-ginecologiche sono sostenute da biofilm

patogeni (Tabella II) 24, 32, 34-36 spiegherebbe

l’assente o incompleta risposta ai

farmaci e l’alta presenza di forme morbose

recidivanti uro-ginecologiche antibiotico resistenti,

insensibili agli effettori della risposta immune 37

e tendenti alla cronicizzazione 28, 38-42.

I biofilm patogeni presentano due localizzazioni

principali: extra- e intracellulari.

Localizzazioni extracellulari

I biofilm in vagina sono soprattutto extracellulari,

cioè posti alla superficie delle cellule

che rivestono la parete della vagina e

aggettano quindi verso la cavità, così come

i biofilm che rivestono la cute vulvare, che

aderiscono da un lato ai cheratinociti cutanei,

e si sviluppano poi verso l’esterno. La

struttura dei biofilm extracellulari è costituita

da una matrice esopolisaccaridica nella

quale sono scavati minuscoli canali d’acqua

che si anastomizzano fra loro, formando

una sorta di sistema circolatorio primitivo.

Essi possono organizzarsi sulla superficie di

differenti mucose o di supporti inerti, quali

i dispositivi medici 26. In ginecologia, sono

di particolare interesse i biofilm che compaiono

sulla superficie di dispositivi medici,

quali anello contraccettivo vaginale, pessari,

dispositivi intrauterini, impianti sottocutanei,

cateteri. I biofilm, sia a sviluppo sopramucoso,

sia su supporto inerte, stanno

assumendo un’importanza rilevante in molte

infezioni croniche e da impianti biomedici,

a carattere recidivante. Infatti, l’involucro

polisaccaridico, secreto dai microrganismi

patogeni, agisce come un sistema di protezione

(simile ai reticolati per le trincee di

guerra) che si oppone alla penetrazione dei

farmaci e agli effettori della risposta immunitaria.

Grazie a questa protezione, i microrganismi

presenti nel biofilm assumono uno

stato di bassa attività metabolica, mostrano

un’aumentata resistenza alle difese immunitarie

dell’ospite e alla terapia antibiotica,

sia perché meccanicamente più protetti e

quindi meno raggiungibili dagli stessi, sia

perché la limitatissima attività metabolica,

simile ad una sorta di quiescenza, relativa e

reversibile, li rende meno vulnerabili anche

ai princìpi attivi che li riuscissero a raggiungere28.

Nella parte più profonda del biofilm

è presente una sottopopolazione di cellule

batteriche quiescenti (0,1-1%) denominate

persister cells, completamente resistenti agli

antibiotici e alle difese immunitarie, pronte

a ripristinare la carica batterica preesistente

una volta completata la terapia antibiotica. A

differenza delle cellule batteriche resistenti

che crescono e si moltiplicano in presenza

di antibiotici, le persisters non crescono

in presenza di antibiotici. In questo caso la

resistenza agli antibiotici non è genotipica

cioè portata da plasmidi, troposomi o legata

ad eventi mutazionali, ma dovuta alla strategia

di queste cellule dormienti differenziatesi

in uno stato fenotipico protetto. La presenza

di persister cells nei biofilm batterici e

fungini ci spiega la difficoltà nel trattamento

delle infezioni biofilm correlate 43.

Negli strati profondi dei biofilm extracellulari,

verso quindi la mucosa o la superficie

inerte, si verifica un altro fenomeno di

grande importanza: un’elevata frequenza di

coniugazione tra i batteri che promuove lo

scambio di plasmidi, ossia di codice genetico

a DNA (Appendice 1). Alcuni plasmidi,

infatti, possono contenere geni che inducono

fenotipi batterici con resistenza multipla

agli antibiotici, o codificare per proteine che

interagendo con le molecole antibiotiche

ne neutralizzano l’attività 37, 44-47. I plasmidi

costituiscono una riserva complessa e mobilissima,

estremamente dinamica, di strategie

di aggressione, virulenza e resistenza

di eccezionale duttilità. Il biofilm è un’entità

dinamica, con un gradiente di attività

progressivamente più vivace a partire dalla

superficie (che aggetta verso la cavità) fino

ad arrivare verso la base del biofilm (verso

la mucosa), a più bassa attività metabolica e

può essere presente in organi come la vagina,

il cavo orale o l’intestino 48. In questi distretti,

e in prossimità dei biofilm, troviamo

cellule batteriche in moltiplicazione, pronte

al distacco e a colonizzare altri siti più distanti:

il cosiddetto “biofilm maturo”. In tal

caso, singoli batteri multiresistenti e aggregati

microbici che si distaccano in modo

continuo da un biofilm maturo, sia esso

monospecie, che multispecie, fungono da

inoculo persistente promuovendo nell’organismo

nuovi siti di colonizzazione e dando

luogo alle cosiddette infezioni polimicrobiche,

antibiotico-resistenti a crescita sessile,

tendenti alla cronicizzazione, che spiegano

poi recidività e comorbilità, per esempio tra

cistiti recidivanti e vestibolite vulvare con

vestibulodinìa provocata 4.

Nonostante le difficoltà nell’eradicazione

di batteri patogeni persistenti a livello

dell’apparato uro-genitale, esiste ancora

una limitata consapevolezza a livello clinico

dell’importanza dei biofilm batterici e fungini

nei processi infettivi e della più elevata

farmaco-resistenza ad essi associata 42.

Localizzazioni intracellulari

I biofilm patogeni tipici della vescica sono

caratterizzati da un ceppo di Escherichia

coli uro patogeno (Uro Pathogenic Escherichia

coli, UPEC), responsabile del 75-85%

delle cistiti recidivanti e della formazione

del biofilm intracellulare. In particolare, i

ceppi di Escherichia coli che possiedono

l’antigene K si tolgono il capside, entrano

nelle cellule dell’urotelio dove formano le

cosiddette “comunità batteriche intracellulari”

49-53 (Intracellular Bacterial Communities,

IBCs, Figura 2) 54. I batteri intracellulari

si organizzano in biofilm racchiusi in

una ricca matrice polisaccaridica, circondata

da un guscio protettivo di uroplachina

in prossimità della superficie, dove creano

rigonfiamenti simili a baccelli 38. I biofilm

intracellulari costituiscono ancora una volta

una riserva di germi poco attaccabile dagli

antibiotici e dalle difese immunitarie. Essi

causano infiammazione cronica della parete

vescicale fino a causare una “sindrome della

vescica dolorosa” che può evolvere fino alla

“cistite interstiziale” 55. Il periodo di tempo

che intercorre dalla colonizzazione da parte

di cellule batteriche di E. coli UPEC dell’urotelio

vescicale fino alla cistite interstiziale

conclamata può richiedere fino a 5-7 anni,

durante i quali si assiste ad una persistente

infiammazione negletta nelle sue caratteristiche

fisiopatologiche principali 56.

Figura 2. — Biofilm endogeni: le comunità batteriche intracellulari. Cellule batteriche di Escherichia coli uropatogeno,

principali responsabili del 75-85% delle cistiti recidivanti, possono formare biofilm intracellulari e costituire le “comunità

batteriche intracellulari” a localizzazione anatomica prevalentemente vescicale 54 (tratto da Rosen et al., 2007,

con autorizzazione).

Implicazioni cliniche

Secondo il Center for Disease Control

and Prevention (CDC) di Atlanta, GE, fino

all’80% delle infezioni batteriche che colpiscono

gli esseri umani nei paesi occidentali

è causato da biofilm polimicrobici. Pertanto,

le infezioni ricorrenti uro-ginecologiche

non devono più essere considerate come

infezioni sostenute da un singolo ceppo patogeno

ma come una sindrome polimicrobica

a crescita sessile caratterizzata da un

significativo aumento della carica batterica

aerobica, anaerobica e fungina con eventualmente

un ceppo patogeno dominante 57.

In particolare, Escherichia coli, frequentemente

presente nelle infezioni uro-ginecologiche,

forma un biofilm vescicale e vaginale

che può contenere batteri quiescenti

intracellulari di riserva: le persister cells.

Esse costituiscono circa l’1% degli elementi

batterici, sono completamente resistenti agli

antibiotici e al sistema immunitario, caratteristiche

cruciali responsabili del fallimento

delle terapie antibiotiche nelle infezioni recidivanti.

Completata la terapia antibiotica

o antifungina, infatti, le persister cells prontamente

si riattivano ripristinando la carica

batterica o fungina pre-esistente causando

una ricaduta dell’infezione 37. Il trattamento

antibiotico infatti, può essere risolutivo

sui batteri in fase planctonica, responsabili

delle riacutizzazioni infettive rilasciate dal

biofilm, ma non è in grado di eliminare la

comunità batterica sessile contenuta nello

stesso.

Inoltre, in entrambe le situazioni patologiche

della vescica e della vagina, gli antigeni

rilasciati dalle cellule sessili stimolano

la produzione di anticorpi che non riuscendo

nella corretta opsonizzazione immune

dei batteri all’interno del biofilm, determinano

un danno da immunocomplessi nel

tessuto circostante, contribuendo a cronicizzare

l’infiammazione tissutale e il dolore

che ne consegue anche in presenza di

un’eccellente risposta immunitaria cellulare

e umorale 55, 58, 59. Infine, anche la saltua

ria esfoliazione di batteri e cellule vescicali

dalla superficie del biofilm maturo contribuisce

a rendere tali infezioni croniche e

ricorrenti 37, 53.

Il biofilm è il laboratorio vivente nel quale

i plasmidi dei microrganismi patogeni

sperimentano la più ampia variabilità di

ricombinazioni fino all’emergere di “killer”

biologici antibiotico resistenti che si staccano

dal biofilm maturo per colonizzare altre

sedi locali fino all’invasione sistemica

(Appendice 1).

Fattori predisponenti, precipitanti e

di mantenimento della recidività

Fattori predisponenti

I fattori predisponenti includono:

—— copresenza di Escherichia coli uropatogeno

(UPEC) in vagina e vescica. Tutte

le donne affette da cistiti e vaginiti recidivanti

hanno una colonizzazione vaginale

da Escherichia coli UPE presente anche durante

periodi asintomatici. Lo studio della

composizione degli ecosistemi mostra un

rapporto invertito tra numero di coliformi e

di lattobacilli 67. Inoltre, la presenza di una

vaginite aerobica, o almeno la presenza di

un biofilm polimicrobico 68 vaginale comprendente

Escherichia coli, è stata sempre

rilevata nei giorni precedenti un episodio

di cistite. È stato dimostrato che nei 14 giorni

che precedono una Urinary Tract Infection

(UTI) la presenza di batteri periuretrali

aumenta dal 46% al 90%, la batteriuria dal

7% al 69%, l’esterasi leucocitaria dal 31% al

64%, la sintomatologia vaginale dal 3% al

43% 68. Come pure Escherichia coli UPEC

aumenta in modo significativo con l’aumento

della frequenza dei rapporti sessuali

(P=008) 69. Il biofilm da Escherichia coli,

presente contemporaneamente a livello vescicale

e vaginale, contiene persister cells,

completamente resistenti agli antibiotici e

al sistema immunitario, rendendo tali infezioni

croniche e ricorrenti. La progressione

verso la cronicizzazione è più rapida e gli

episodi di cistite più ravvicinati se il biofilm

vaginale non viene trattato;

—— fattori anatomici: brevità dell’uretra

femminile che facilita la risalita di germi;

—— ipoestrogenismo 1, 70, 71;

—— diabete e fattori dismetabolici associati

1, 72;

—— iperattività del muscolo elevatore

dell’ano 16;

—— fattori sessuali: scarso desiderio, inadeguata

lubrificazione con secchezza vaginale

facilitano le microabrasioni della mucosa

dell’introito vaginale contribuendo a

vaginiti, vestiboliti/vestibulodinia provocata,

dispareunia, ipertono difensivo del muscolo

elevatore, e cistiti postcoitali 1, 14;

—— sindrome del colon irritabile e infiammazione

della parete intestinale (“leaky gut

syndrome”) e stipsi ostruttiva 1, 20, 21.

Fattori precipitanti

Il rapporto sessuale, specie se in presenza

di pregresse vaginiti e cistiti, nonché di

ipertono del muscolo elevatore e di vestibulodinìa

provocata 4 rappresenta il fattore

precipitante più frequente. In effetti, il 60%

delle cistiti recidivanti è postcoitale. Compare

24-72 ore dopo un rapporto sessuale.

La causa è biomeccanica, dovuta al trauma

che la penetrazione determina sull’uretra

e sul trigono quando il muscolo contratto

spinge il membro maschile contro l’uretra

e contro l’osso pubico soprastante. L’uretra,

non più protetta dall’abituale manicotto

vascolare, decongesto a causa del dolore

che inibisce l’eccitazione e la protettiva

congestione vascolare periuretrale, viene

compressa ripetutamente contro l’osso. Il

trauma biomeccanico causa allora infiammazione

tessutale e attiva le IBCs di Eschericha

coli UPEC.

L’esposizione al freddo (cistite “a frigore”)

può scatenare la cistite attiva in presenza di

IBCs.

Fattori di mantenimento

I fattori di mantenimento sono molteplici.

Tra i principali vi sono:

1. l’inadeguata attenzione ai fattori predisponenti

e precipitanti;

2. la mancata/incompleta lettura fisiopatologia

delle cause della recidività e delle

comorbiltà associate;

3. il minimalismo terapeutico, che si limita

anche nelle linee guida internazionali

ad un’escalation di aggressività antibiotica,

sia per tipo di molecole che per durata dei

trattamenti 73;

4. la mancata compliance della donna

alla terapia.

Il razionale per un diverso intervento

preventivo e terapeutico

La progressione verso la cronicizzazione è

più rapida e gli episodi di cistite più ravvicinati

se il biofilm vescicale o vaginale non

viene trattato. Oggi è evidente che la migliore

terapia antibiotica a nostra disposizione

è solamente in grado di risolvere un episodio

acuto di cistite, mentre è completamente

inefficace nella prevenzione delle infezioni